Asma protoplastlarında CRISPR/Cas9 aracılı genom düzenleme

OpenAlex Türkçe

Amaç: Bu çalışmanın amacı, CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 (CRISPR-associated protein 9) aracılı genom düzenleme yöntemi kullanılarak asma protoplastlarında hedefe yönelik mutasyonun gerçekleştirilmesidir. Materyal ve Yöntem: Chardonnay asma çeşidinde CRISPR/Cas9 aracılı genom düzenleme için hedef gene uygun gRNA tasarımı yapılarak, hem gRNA’yı hem de Cas9 ve GFP genlerini içeren final CRISPR/Cas9 vektörü elde edilmiştir. Asma yapraklarından protoplast izolasyonu ve transformasyonu gerçekleştirilerek, transformasyon ve mutasyon verimliliği analiz edilmiştir. Araştırma Bulguları: Çalışmada Chardonnay yapraklarından yapılan protoplast izolasyonunda 1 g taze yapraktan 1x107 protoplast elde edilmiştir. VvPDS genini hedef alan vektörün (~10 kb) protoplastlarda transformasyon verimliliği %40-60 iken, sadece GFP genini içeren vektörde (~3 kb), transformasyon verimliliği %80-90 olarak bulunmuştur. Vektör büyüklüğü transformasyon verimliliğini büyük oranda etkilemiş, vektör büyüklüğü arttıkça verimlilik azalmıştır. Transformasyon gerçekleşmesine rağmen, hedeflenen mutasyon doğrulanamamıştır. Sonuç: Çalışmada asma protoplastlarında CRISPR/Cas9 aracılı genom düzenleme için ilk aşama olan gRNA tasarımından son aşama olan protoplast transformasyonuna kadar uygulanan basamaklar başarılı bir şekilde gerçekleştirilerek, sistemin sorunsuz uygulanabilirliği gösterilmiştir. Uygulanan protokoller ve elde edilen sonuçlar asmada hedef mutasyonların gerçekleştirilmesi amacıyla yapılacak olan diğer çalışmalarda kullanılabilecektir.